Kako se proizvodi inzulin?

by Antun Paulin

• 0
• Riječ struke, Terapija

Pogled u tvornicu inzulina (i zašto ga ne možemo pripravljati doma)

Sve do 80-ih godina 20. stoljeća, teretni vlakovi dovozili su tone svinjskih gušterača u Indianapolis, glavni grad američke savezne države Indiane, nabavljajući ih s okolnih uzgajališta svinja. Radnici su pretovarivali hrpe ružičastih svinjskih iznutrica u zgradu pokraj tračnica, koja danas služi kao garaža pored tvornice Eli Lilly & Co., prve koja je masovno proizvodila inzulin u Americi. U tvornici su ovi organi korišteni kao sirovina za dobivanje inzulina, lijeka koji spašava živote dijabetičara.

Prešli smo dug put od vremena kada je bilo potrebno dvije tone svinjskih gušterača da bi se dobilo tek 225 grama pročišćenog inzulina u prahu. Danas, inzulin koji dolazi u bočicama, penovima i pumpama ne dobivamo od svinja i krava nego uz pomoć posebnih mikroorganizama, sposobnih za stvaranje inzulina. Zahvaljujući ovim malim bićima, hormon inzulin (i to u obliku puno sličnijem humanom inzulinu) dostupan je milionima inzulinovisnih dijabetičara širom planeta.

Rađanje biotehnologije
Inzulin u tijelu obavlja funkciju hormona, a prema kemijskoj strukturi spada u proteine. Proteini su velike molekule izgrađene od manjih molekula koji se nazivaju aminokiselinama. Postoji 20 različitih aminokiselina (npr. triptofan, glicin, lizin, prolin, fenilalanin, aspartat, da spomenemo samo neke, na shematskim prikazima proteina obično označene skraćenicama Trp, Gly, Lys, Pro, Phe, Asp…) koje se mogu međusobno povezivati i tako graditi proteine. Poput slova u riječima, redoslijed i ukupni broj aminokiselina u pojedinom proteinu jasno su definirani. Ljudski inzulin sastoji se od 51 aminokiseline, kao što je prikazano na slici:

 Shematski prikaz molekule humanog inzulina

Ljudski (humani) i svinjski inzulin razlikuju se međusobno u samo jednoj aminokiselini, dok se humani i goveđi razlikuju u tri aminokiseline.

Međutim, postoji problem: naš imuni sustav je strogi kontrolor i stoga jako brzo uoči da je životinjski inzulin njemu stran. Neki ljudi s dijabetesom razviju imunu reakciju na svinjski i goveđi inzulin, tako da kod njih ti inzulini s vremenom gube djelotvornost. Drugi problem sa životinjskim inzulinima jest održivost proizvodnje – potrebno je puno sirovina za dobivanje nevelike količine produkta, da ne spominjemo miomirise.

Sedamdesetih godina prošlog stoljeća, u potrazi za novim lijekovima znanstvenici su počeli smišljati načine za sintezu ljudskih proteina u laboratorijskim uvjetima. Igrali su se s genima i malenim organizmima poput bakterija i gljivica. Genska informacija prenosi se uz pomoć molekula deoksiribonukleinske kiseline, DNA. Poput proteina, i molekula DNA je polimer tj. sastavljena je od lančano povezanih malih molekula, u ovom slučaju tzv. nukleotida. Nukleotid koji je sastavna jedinica DNA sastoji se od dušične baze (to može biti adenin, citozin, guanin ili timin, ACGT), šećera deoksiriboze i fosfata. Genetički inženjeri uspjeli su sintetizirati ljudske gene u laboratoriju i našli su način kako precizno posložiti nukleotide u odgovarajućem redoslijedu. To je omogućilo i dobivanje gena odgovornog za sintezu inzulina.

Na koji način geni upravljaju sintezom inzulina? Geni, zapravo odsječci molekule DNA, sadržavaju upute za stvaranje određenog proteina. (Niz od tri nukleotida, triplet, kodira sintezu pojedine aminokiseline, tako da slijed tripleta u genu određuje slijed aminokiselina u proteinu, op. prev.) Znanstvenici su uskoro otkrili kako mogu ubaciti sintetski dobiven gen u neku DNA molekulu koja služi kao nosač, kako bi omogućili stvaranje željenog proteina. Naravno, potrebno je još ponešto osim DNA da bi se dobio protein uz pomoć gena. Molekula DNA treba se ubaciti u neki organizam koji sadržava svu preostalu biomašineriju potrebnu za proizvodnju proteina.

Godine 1978. znanstvenici zaposleni u mladoj i perspektivnoj tvrtki Genentech objavili su da su uspjeli ubaciti gen za sintezu ljudskog inzulina u jedan bezopasni soj bakterije Escherichia coli, te da je ona zatim proizvela inzulin. Genentech se zatim udružio s tvrtkom Lilly, koja je 1982. na tržište plasirala humani inzulin pod imenom Humulin. Bio je to prvi lijek na svijetu dobiven uz pomoć rekombinantne DNA tehnologije. Ovaj biotehnološki postupak sada se koristi širom svijeta, kako za potrebe fundamenatalnih znanstvenih istraživanja tako i za primjenu u farmaceutskoj industriji, stvarajući tisuće različitih proteina koji pomažu znanstvenicima pri rasvjetljavanju biokemijskih procesa u ljudskom tijelu kao i liječnicima pri tretiranju bolesti poput raka, reumatoidnog artritisa, i naravno, dijabetesa.

Biotehnologija je omogućila ljudima s dijabetesom da koriste inzulin koji je potpuno jednak onome koji proizvode gušterače zdravih ljudi. Međutim, bio je to tek početak za inzuline. Jednom kad su mogli dizajnirati i oblikovati gen koji kodira inzulin, znanstvenici su mogli dizajnirati i nove oblike inzulina, kakvi do tada nisu postojali u prirodi. Radi se o inzulinskim analozima poput Humaloga (generičkog naziva lispro) i Lantusa (generički glargin). (Dostupni su još i analozi Novorapid (aspart), Levemir (detemir) i Apidra (glulizin), op. prev.) Analozi su uskoro postali vrlo popularni među liječnicima i pacijentima. Genetički inženjeri napravili su vrlo malene promjene u aminokiselinskom slijedu u ovim proteinima, što je dovelo do nekih novih poželjnih svojstava koja se odnose na brzinu djelovanja inzulina u organizmu. Ova nova svojstva dozvolila su dijabetičarima više fleksibilnosti u svakodnevnoj kontroli glukoze u krvi što je rezultiralo boljom glikoregulacijom i što duljim odgađanjem, pa čak i sprečavanjem pojave dotada uobičajenih komplikacija dijabetesa.

Radi zaštite od konkurencije, farmaceutske tvrtke rijetko dozvoljavaju nezaposlenicima pristup u svoje proizvodne pogone. Međutim, Lilly je omogućio novinarki časopisa Diabetes Forecast da izbliza vidi dijelove proizvodnje inzulina u njihovoj tvornici u Indianapolisu. Lillyjevi tvornički pogoni u Indianapolisu protežu se na 128 tisuća kvadratnih metara, što odgovara površini 18 nogometnih igrališta. Prema riječima dr. sc. Fionnuale Walsh, Lillyjeve više potpredsjednice za globalnu kvalitetu, tu se bez prestanka proizvodi humani inzulin Humulin i inzulinski analog Humalog.

Još dvije tvrtke, Novo Nordisk i Sanofi, proizvode inzulin i analoge na sličan način, iako su neki detalji proizvodnog procesa prilično različiti (vidjeti odlomak „Drugačiji recept“).

U Lillyju, bakterije koje proizvode inzulin uzgajaju se u spremnicima volumena od čak 50 tisuća litara, tzv. fermentorima. U tvornici se nalazi više od 5 tisuća fermentora. Količina inzulina proizvedena tijekom jednog ciklusa u samo jednom fermentoru dovoljna je za godišnje potrebe više tisuća ljudi. „Naši pogoni dizajnirani su za proizvodnju inzulina (koji se prvo dobije u kristalnoj formi) u količinama od nekoliko tona!“ rekla je F. Walsh.

Proizvodnja humanog inzulina u samim počecima primjene rekombinantne DNA tehnologije krenula je od vrlo malenih količina bakterije E. coli. Epruvete s bakterijama drže se u hladnjači na temperaturi od -70 Celzijevih stupnjeva i tako mogu preživjeti desetljećima. Lilly je uzgojio početnu turu bakterija, koju danas nazivaju „glavna banka stanica“, još prije nekih 35 godina. Iz nje su uzgojene sve naredne generacije bakterija korištene za proizvodnju inzulina. Svaki ciklus proizvodnje započinje uzimanjem jedne epruvete bakterija iz glavne banke stanica i bakterijskim rastom i uzgojem. Započinje se sa samo pola grama bakterija, ali one se zatim nastave razmožavati čudesnom brzinom, udvostručujući svoj broj svakih 20 minuta. Jednom kad se epruveta napuni, bakterije se prebacuju u sve veće i veće posude, zatim u boce i na kraju u velike spremnike. Bakterijama su potrebni hrana i voda za rast; od hrane im je dovoljno nešto šećera, soli i dušika. Radnici u tvornici brinu se da bakterije sve to dobivaju u dovoljnim količinama. Pored hrane, u smjesu treba dodati i odgovarajući antibiotik koji će spriječiti rast nekih drugih, nepoželjnih mikroorganizama. E. coli koja služi za proizvodnju inzulina stoga mora biti otporna na antibiotik koji se koristi u tu svrhu, tako da u smjesi raste samo naša, željena Escherichia koja će kasnije stvarati inzulin. Nakon nekoliko dana razmnožavanja, bakterije su sad spremne za ono za što se uzgajaju – za proizvodnju inzulina. Do tog trenutka, one nisu mogle proizvoditi inzulin zahvaljujući prisustvu jednog posebnog proteina (engl. repressor), smještenog u njihovom organizmu u blizini gena za inzulin. Da bi proizvodnja mogla započeti, potrebno je onemogućiti daljnje djelovanje ovog proteina. To se postigne tako da se u smjesu u spremniku doda posebna kemikalija (engl. inducer) koja će osloboditi gen za stvaranje inzulina. Bakterije smjesta počnu raditi stvarajući inzulin koji ostaje unutar njihovog organizma. Nakon točno određenog vremena, obično nekoliko sati, vrijeme je za skupljanje i proces izolacije inzulina iz hrpe bakterijskog smeća.

Pročišćavanje

Prvi korak u pročišćavanju dobivenog inzulina jest odvajanje bakterija od ostatka smjese (tzv. „juhe“). Ovo se radi uz pomoć moćne centrifuge, tako da bakterije ostanu na dnu posude, „ocijeđene“ od ostatka smjese. Juha se zatim uklanja i umjesto nje bakterijama se dodaje tekućina koja sadržava tvari koje mogu probiti stanične membrane, tako da bi proizvedeni inzulin izašao iz bakterija.

Pri svakom od mnogih koraka pročišćavanja duplo se provjerava čistoća produkta. Čak i proces pakiranja se pažljivo prati: svaka se bočica inzulina fotografira iz različitih kuteva a zatim se računalno provjerava ispravnost. Cilj je osigurati da se uvijek dobije čist i pouzdan proizvod, tako da ljudi s dijabetesom imaju jednu brigu manje.

U ovoj fazi, dobiveni produkt zapravo još uvijek nije inzulin. To je „proinzulin“, biološki neaktivna molekula koja nastaje u koraku prije samog inzulina i iz kojeg će on tek nastati.

Sad je potrebno dodati jedan enzim koji će „odrezati“ jedan dio proinzulina nakon čega dobijemo molekulu inzulina samog sastavljenu od 51 aminokiseline, a odrezani dio naziva se C-peptid. (To je također hormon i nekada se mjeri u krvi dijabetičara jer govori koliko netko proizvodi vlastitog inzulina.)

U sljedećoj fazi pročišćavanja, tekuća smjesa u kojoj je inzulin propušta se kroz gigantske kromatografske kolone koje izgledaju kao velike replike sličnih aparatura koje se mogu vidjeti u kemijskom laboratoriju. Radi se o vertikalnim cijevima s posebnim punilima koja djeluju poput sita, odvajajući inzulin od ostalih kemijskih spojeva prisutnih u smjesi na osnovu razlika u električnom naboju, kiselosti, veličini molekula i drugim svojstvima.

Inzulin koji izlazi na samom dnu kolone već je prilično čist, ali njegov oblik (tj. način na koji se „smotao“) je takav da još uvijek ne može biti biološki aktivan. Da se to popravi, potrebno je dodati još neke enzime.

Posljednji korak prije nego što je inzulin spreman za pakiranje je kristalizacija. Inzulin se miješa s cinkovim solima što pomaže da se stvore stabilni kristali, a zatim se suši sve dok se ne preostane suhi prah sastavljen od sitnih blistavih kristala. Kristali se mogu ponovno miješati s vodom tako da se dobije otopina koja se pakira u bočice, ampule i penove te se zatim kao gotov proizvod distribuira širom svijeta.

Kontrola kvalitete Proizvođači inzulina puno pažnje posvećuju kontroli kvalitete. Svaka faza proizvodnje pomno se prati i kotrolira. Naprimjer, nakon što bakterije počnu rasti, znanstvenici u Lillyju nekoliko puta provjeravaju prethodno ubačeni gen inzulina, da slučajno nije došlo do njegove mutacije. Za vrijeme rasta nužno je održavati sterilnost, jer samo jedan nepoželjni patogen može uništiti cijelu turu bakterija. Zbog toga je potrebno poštovati najviše standarde čistoće – to vrijedi za vodu, zrak, osobe koje rade u pogonima. F. Walsh kaže da bi se na podu pogona gdje su smješteni spremnici u kojima rastu bakterije mogla izvesti kirurška operacija, toliko je čist i sterilan. Pri svakom od mnogih koraka pročišćavanja duplo se provjerava čistoća produkta. Čak i proces pakiranja se pažljivo prati: svaka se bočica inzulina fotografira iz različitih kuteva a zatim se računalno provjerava ispravnost. Cilj je osigurati da se uvijek dobije čist i pouzdan proizvod, tako da ljudi s dijabetesom imaju jednu brigu manje.

Opskrba i cijena

Zasada postoje ukupno tri tvrtke koje snabdijevaju inzulinom cjelokupno tržište Sjedinjenih Američkih Država. (Ove tvrtke pokrivaju 93 % ukupnog svjetskog tržišta. Ostatak se odnosi na neke kineske i indijske proizvođače, ali nitko od njih ne proizvodi inzulinske analoge, op. prev.) Sigurnosne mjere u Elly Lilly i u drugim tvornicama garantiraju stabilnu opskrbu svjetskog tržišta inzulinom.

Cijena inzulina drugo je često pitanje oko kojega se brinu pacijenti i liječnici. Generički inzulini bili bi jeftiniji u odnosu na originale. Farmaceutske tvrtke nisu sretne kada postoje generičke verzije njihovih skupih lijekova, ali naravno da ih pacijenti i osiguravajuće kuće vole – u 2009. godini 75% svih recepata za lijekove izdanih u SAD odnosili su se na generike. Što se inzulina tiče, do sada se proizvođači nisu trebali natjecati s generičkim verzijama svojih proizvoda, ali takva situacija polako se bliži kraju. Patenti za inzulinske analoge isteći će u nekoliko narednih godina.

Kao što nam je pokazao obilazak Lillyjevih pogona, priprava bioloških lijekova vrlo je složena, tako da generički inzulini vjerojatno neće biti pripravljani na potpuno jednak način kao originali. Male razlike u proizvodnji mogu dovesti do drugačijeg konačnog proizvoda pa su potrebni dodatni koraci koji će osigurati da pacijenti ipak dobiju lijek odgovarajuće kvalitete. Američka agencija za hranu i lijekove (FDA) postavila je rigorozne kriterije za odobravanje tzv. biosličnih lijekova, tj. generičkih inačica lijekova, uključivši i inzulin, koji se proizvode uz pomoć mikroorganizama. Razvijeni su posebni testovi koji trebaju osigurati da bioslični lijekovi zadovoljavaju jednake standarde sigurnosti i djelotvornosti kao i originalna verzija. Do sada od FDA još nijedan proizvođač nije zatražio odobravanje nekog svog generičkog inzulina. Hoće li generički inzulini jednom stići na tržište? Vrijeme će pokazati, ali ukupna prodaja inzulina u vrijednosti od 16.7 milijardi dolara u 2011. godini – a očekuje se da će taj broj rasti zbog sve većeg broja oboljelih – ukazuje da farmaceutske tvrtke imaju financijski interes koji ih gura u tom smjeru.

Drugačiji recept Nakon što smo naučili sve ove zanimljive stvari oko bakterija, osvrnimo se na još jedan mikroorganizam koji se može koristiti pri proizvodnji inzulina. Novo Nordisk, koji je počeo proizvoditi humani inzulin 1987. za to koristi kvaščeve gljivice, jednostanični organizam. Prema riječima Jensa Kirkegaarda Baeka, Novo Nordiskovog stručnjaka za proizvodnju inzulina, ovi mikroorganizmi imaju određene prednosti u odnosu na bakterije. Za razliku od bakterija, gljivice izbacuju inzulin izvan stanice, izravno u juhu, kaže Baek, što znatno olakšava proces pročišćavanja. Druga prednost je to što je inzulin koji se dobiva uz pomoć gljivica kvasca u formi koja zahtijeva manje naknadnih dodavanja enzima da bi se dobio konačni oblik. Zahvaljujući tome, moguće je kontinuirano odvođenje gljivica iz spremnika, tako da nije potrebno obrađivati ogromnu količinu gljivica odjednom. To znatno olakšava proces odvajanja inzulina od ostatka juhe. Daljnje pročišćavanje ide kao i kod Lillyja, korištenjem kromatografskih kolona.

Napisala: Erika Gebel

Članak je objavljen u časopisu Diabetes Forecast, u srpnju 2013.

Prevela i prilagodila: Danijela Barić